2012年6月4日至7日，受行业专项首席科学家孙效文研究员的委派，我们两人事隔两年，再次到水科院长江水产研究所和中科院水生生物研究所，对他们承担的“鲢、鳙分子辅助育种技术建立和应用”、“鳙生长性状核心种群的建立”和“银鲫抗病分子育种技术与抗病核心群体的建立”执行情况进行了检查。两个单位在接到效文先生通知后，都十分重视，编写了专门的多媒体和书面汇报材料，长江所在家的曹经哗、肖汉兵两位副所长亲自陪同参观李忠武汉中心实验室，一起听取课题组汇报，并针对专项中2012年实施方案要求提出落实意见，邹桂伟所长得知检查组到所后，提前从昆明回所听取我们对课题执行情况意见，科技处新上任的邹世平处长和课题主持人李忠、水产养殖与遗传育种室副主任梁宏伟等陪我们考察了荆州窑湾试验场和石首市老河长江四大家鱼原种场试验基地；水生所原所长桂建芳亲自接待，科研业务处副处长刘莉参加汇报会，童金苟、周莉两位主持人陪同我们考察了水生所的关桥试验基地和石首市老河长江四大家鱼原种场试验基地。现将2012年5月底前有关情况汇报如下。
一、“鲢、鳙分子辅助育种技术建立和应用” 执行情况
该课题由长江水产研究所李忠老师主持。
（一）品种、品系鉴定及推广示范工作
1、“长丰鲢”新品种的审定和推广
2010年选育鲢通过全国水产原良种审定委员会审定，命名为“长丰鲢”，品种登记号为：GS-01-001-2010。结合大宗淡水鱼产业体系专项需要，2011年推广“长丰鲢”水花8000多万，夏花乌仔接近900万；2012年已推广水花鱼苗接近1.2亿尾，夏花乌仔接近950万尾。推广数量呈逐年上升趋势。这些鱼苗是课题团队在长江水产研究所所窑湾试验场和潜江西大垸国营农场水产养殖公司两个基地繁殖而得。
                         长丰鲢示范推广地区及数量

2、品系选育及家系建立
（1）鲢选育后备选育系的建立
该选育系为1997进行第一代雌核发育，选择生长快、体型好的个体于2008年进行第二代雌核发育，现已性状稳定，并达到初次性成熟，但尚未达到进行品种选育的国标年龄。2013年雌核发育系2代可以繁育，建立遗传背景稳定的新品系。
（2）野生鳙亲本培育
2007年选留野生鳙进行培育，2012年初次性成熟，拟2013年开始野生鳙家系建立。
（3）鲢家系的建立
现课题组建立长江野生鲢（监利段）家系1个，长江野生鲢（石首段）7个，用于新品种选育。
（4）耐低氧鲢群体建立及后代耐性检测
利用2007年发现的耐低氧鲢群体进行了耐低氧性状分子标记的开发，并繁育了后代，拟利用获得的侯选标记进行验证。
（二）鲢、鳙DNA分子标记开发及遗传连锁图的构建
1、微卫星标记开发
通过富集文库构建和筛选测序得到的725个微卫星完整序列，共获得422对稳定性和特异性较高的微卫星引物。
2、遗传连锁图的构建
通过卫星DNA标记和AFLP标记得到两张鲢性别平均连锁图谱，一张是由全微卫星DNA标记组成的性别平均图谱，包含233个微卫星标记；另一张是由微卫星DNA标记和AFLP标记组成的SSR-AFLP性别平均图谱，包含483个标记其中245个SSR标记，238个AFLP标记。另外，还分别构建了SSR-AFLP雌性连锁图谱和SSR-AFLP雄性连锁图谱。
3、利用cDNA-AFLP技术获得鲢耐低氧相关基因
采用cDNA-AFLP技术分离出低氧组相对于对照组的差异表达片段，获得33个片段跟低氧胁迫相关，根据其在低氧胁迫中的功能可将其分为信号转导、氧化应激、低氧应答、机体保护、细胞凋亡、内质网应激、能量代谢七大类。
4、低氧相关蛋白基因标记的筛选和验证
在低氧胁迫下，心脏中共检测中表达差异的蛋白数量为91个，根据GO-MF分析知道，91个差异蛋白中catalytic activity占37%，其次是transporter activity占20%。structural molecule activity和protein binding各占12%。在91个蛋白中，其中低氧下上调基因24个，下调基因67个
5、鲢低氧胁迫相关基因的克隆和验证
（1）鲢转铁蛋白基因cDNA的克隆及在胚胎期的表达分析
克隆了鲢转铁蛋白基因(Transferrin, Tf)的全长cDNA序列，该cDNA全长2365bp，包含2025bp开放阅读框(ORF)，编码674个氨基酸。
（2）Cu/Zn-SOD和MnSOD在鲢中的表达模式
采用TR-PCR和RACE 方法首次从鲢中克隆得到Cu/Zn-SOD和MnSOD cDNA序列全长。鲢Cn/Zn-SOD cDNA序列开放阅读框长为465bp，编码154个氨基酸，同时鲢MnSOD cDNA序列开放阅读框长为675bp，编码224个氨基酸。
6、全同胞极端生长快—生长慢个体进行表型和基因型分析
利用已开发的SSR、AFLP分子标记对全同胞极端生长快—生长慢个体进行了基因分型分析，该研究正在进行中。
（三）存在问题
1、鲢、鳙亲本培育周期长的限制。鲢初次性成熟要4年，鳙5年，亲本培育周期较长，而强行缩短亲本培育周期，又会发生后代小型化、性早熟化的趋势，偏离育种核心理念。
2、理论工作的验证，一个理论的验证需要从不同层次、不同的角度通过多种现有技术对其可靠性进行验证，而且在验证过程中，常常会有新的发现，会导致自己先前的知识理论需要更新或者推翻重新建立，这也是科研研究不可预测性的一种真实体现。目前课题组在细胞骨架在低氧胁迫下的表现问题研究方面出现了一些困惑：到底是现有理论有问题，还是目前研究存在问题。
细胞骨架在维持细胞形态，承受外力、保持细胞内部结构的有序性方面起重要作用，而且还参与许多重要的生命活动，如：在细胞分裂中细胞骨架牵引染色体分离，在细胞物质运输中，各类小泡和细胞器可沿着细胞骨架定向转运；在肌肉细胞中，细胞骨架和它的结合蛋白组成动力系统；在白细胞(白血球)的迁移、神经细胞轴突和树突的伸展等方面都与细胞骨架有关。
可以说细胞骨架是维持生命活动的基本，细胞骨架主要有包括微管、微丝和中间丝三大物质组织，微管由tubulin组成，微丝由actin组成。研究人员在研究生命活动现象时，通常采用细胞骨架作为标准参照，默认为是恒定不变的。现在研究基因功能时在mRNA水平通常采用B-actin和A-tubulin；在蛋白水平上，惯例是3大标志物，tubulin、actin、GAPDH，不用这三大标志物做参照，审稿人员会以没有参照为理由，直接拒稿（后面有两个文章的连接，都是默认为骨架蛋白actin是不变的，包括我们前期的文章）。
在去年下半年的研究中发现，鲢低氧胁迫下tubulin 和actin并非恒定不变，在不同器官中有不同的变化模式。鲢在肌肉和肝脏中，tubulin 和actin在窒息时，并未导致细胞骨架的崩溃，但结果显示tubulin 和actin并非恒定不变的，而心脏作为机体最关键的器官，细胞骨架的组成蛋白出了问题，导致心脏行使功能时受限（现有免疫组化图片，更清晰的图片现在结果尚未出来）。
现在问题就是证实了细胞骨架在低氧下出了问题，不但鱼类的很多研究结果，人类和老鼠的很多结果也是不可靠的，内参标志物本身在低氧下是变化的，用变化的标志物作为参照得出的结果，可想而知。
前些年课题组做基因功能验证的时候，也是参照前人的文章，直接拿actin和tubulin作为参照，并未去验证标志物是否恒定不变。这个也是发表文章的弊端，只要引用前人发表文章的技术方法，在自己所投文章中体现的数据的真实性和可靠性就是不被怀疑的。
低氧下研究基因功能的文章比比皆是，老鼠和人类中更多，下面这篇文章就是采用的actin作为参照，研究低氧下Hypoxia-Inducible Factor 1A（低氧诱导因子1A）蛋白水平变化的。
The Expression of Hypoxia-Inducible Factor 1A Is a Favorable Independent Prognostic Factor in Renal Cell Carcinoma（
http://clincancerres.aacrjournals.org/content/11/3/1129.full.pdf+html）
下面这个文章是课题组自己发表的文章，英国的杂志—鱼类贝类免疫学—影响因子3点多，也是采用的actin做为参照。
Molecular cloning and differential expression pattern of copper/zinc superoxide dismutase and manganese superoxide dismutase in Hypophthalmichthys molitrix（http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1050464810003451）

二、“鳙生长性状核心种群的建立” 执行情况
该课题由中科院水生生物研究所童金苟老师主持。
1、鳙家系等遗传材料构建
2011-2012年春鱼类繁殖季节，构建一对亲本的鳙全同胞自交家系2个，多亲本繁殖的混合家系3个（放池塘养殖2个）； 继续养殖去年获得的子代较多的鳙雌核发育家系2个(分别养殖在湖北石首和武汉新洲)；2012年新建雌核发育系1个，新获得鳙有丝分裂雌核发育家系1个（存活14尾）仍在养殖中。
2、SSR和SNP遗传标记开发和应用    
已对约2000个来源于基因组和cDNA的微卫星标记进行了开发和多态性筛选。在鲢、鳙杂交两个F1家系中初步完成了500多个SSR位点的遗传分型（genotyping）, 鳙图谱构建仍在进行中。在GH，MSTN, IGF1等基因中发现SNP位点6个。继续克隆了与鳙生长、生殖调控轴有关的脑肠肽等4个功能基因的全长cDNA,从中发掘SNP的工作正在进行中。
应用⑴ QTL分析：在2008年建立的一个鳙全同胞家系F1子代群体中，获得了两个年度的生长性状测量数据（体长，体重，体高，头长等）。在一龄鳙作图材料中已完成200多个微卫星标记的遗传分型，鳙生长QTL分析正在进行中。该家系F1代有望在明年（2013年）进行人工繁殖获得F2。
应用⑵基因(微卫星-着丝粒)作图：利用100多个鳙SSR和6个鳙雌核发育二倍体家系为材料，获得66个SSR与着丝粒之间的重组值（遗传距离）信息，将1个着丝粒定位到过去发表的1个鳙连锁群中，为鳙遗传图谱整合和大规模M-C 作图和着丝粒定位打下了初步基础。
3、利用生长性状相关的遗传标记对鳙群体和家系进行选择
在一个鳙鱼混合家系（10对雌雄亲本的繁殖后代）一龄鱼测量性状中，MSTN基因的1个SNP （g.2770C>A）多态性与生长性状有显著相关性（P<0.01），CC基因型是全长、体长和体重指标的优势基因型 （见附表）。在上述同一个遗传材料中，IGF1基因2个SNP多态性与所有的生长指标都没有显著相关性（P>0.05）。 MSTN基因SNP多态性对二、三龄鳙生长指标的关联性分析仍在进行中。
附表：鳙MSTN（myostatin）SNP g.2770C>A多态性与生长性状的关联性分析*

* 同一行中不同字母表示差异显著（P<0.01）
    在繁殖季节，分别从湖北石首和武汉新洲来源于长江的鳙繁殖亲本采集鳍条样本50尾和30尾，正在利用MSTN基因g.2770C>A位点和SSR群体进行多态性分析。对2012年制备的2个混合群体中所包含的家系数目正在进行SSR亲子鉴定；混合子代群体的随机抽样个体的MSTN的SNP基因型分析正在进行中。 这些混合家系的仔鱼已在池塘养殖中，下半年可以得到性状数据，可以进行交配组合和家系的生长评价和初步标记辅助选择。
    雌核发育家系：2011年春季获得的雌核发育鳙家系的SSR和SNP分析正在进行中，待获取周年或1.5年生长性状数据后，进行基因型-性状整合分析。2012年获得的雌核发育鳙家系生长性状数据待测，今年新获得的有丝分裂雌核发育（双单倍体）鳙家系现存少数个体仍在养殖中，其亲子关系和子代遗传纯合度等有待分子标记鉴定，性状分析有待下半年或年底进行。
4、2012年课题阶段成果
   发表或正式接受SCI论文2篇。正在撰写中的论文1篇。
Liu L., Yu X., Tong J. * 2012. Molecular characterization of myostatin (MSTN) gene and association analysis with growth traits in the bighead carp (Aristichthys nobilis).  Molecular Biology Reports (accepted) （SCI）
Liu L., Tong J.*, Guo W., Yu X.  2012. Microsatellite-centromere mapping in bighead carp (Aristichthys nobilis) using gynogenetic diploid families. Aquaculture Research (in press) （SCI）
5、石首老河长江四大家鱼原种场，位于湖北省石首市大垸镇，东临长江，在长江中游的荆江中段北岸，属全民所有制副科级事业单位。全场总面积8500多亩，其中大水面天然生态库8000多亩，鱼池410亩；42名职工中高工1人，工程师4人，技术员、技工26人，并以水科院长江水产研究所为技术依托单位。该场从1988年开始为社会提供长江四大家鱼原种，所供“四大家鱼”原种全部通过从长江灌江纳苗及人工捕捞江苗培育而成，具有生长速度快、抗病能力强、个体大、繁殖力旺盛等优势。2000年12月被农业部授予“国家级水产原种场”。现每年可生产四大家鱼原种及后备亲本8万公斤，一龄鱼种60万尾。2008年底在国家支持下，实施了石首老河长江四大家鱼原种场改扩建项目，2010年底顺利通过竣工验收，使生产和试验条件进一步改善。2008年，石首老河长江四大家鱼原种场通过农业部遴选，加入现代农业产业技术体系，成为大宗淡水鱼类产业技术体系石首综合试验站依托单位。现主要有中科院水生生物研究所和水科院长江水产研究所在进行一些重大科研项目试验研究。

三、“银鲫抗病分子育种技术与抗病核心群体的建立”执行情况
该课题由中科院水生生物研究所周莉老师主持。
（一）新品种选育工作
由于异育银鲫新品种“中科3号”在2009年已获通过，课题主要采取两种选育路线进行“中科4号”的选育工作：
选育路线一：在进行全国资源考察的基础上，从部分水系或湖泊中选取其中的优势个体，带回育种基地养殖。首先进行流式细胞仪DNA含量鉴定，确定为三倍体银鲫后，再进行血清转铁蛋白分析，判别是否与已推广的异育银鲫的遗传差异。如果是新的克隆，则在第2年进行雌核生殖繁育后代，获得育种核心群体。2009年选取了洞庭湖3尾个体，太白湖1尾个体，潇水1尾个体，以及蔡甸基地1尾个体进行人工繁育。
选育路线二：将克隆E系的卵子与团头鲂受精后，冷休克处理受精卵，获得融入有团头鲂染色体片段的复合鲫（F系）。2009年选取F系2尾个体进行人工繁育实验。
将这8尾个体，以及高体型异育银鲫（D系）以及异育银鲫“中科3号”（Ａ＋）各一尾个体，共10尾鱼进行人工繁育，并进行混养。
经过2009年~2010年两年生长对比实验后，2011年将选育重点集中在复合鲫（F系）上。复合鲫是将E系银鲫的卵子与团头鲂精子受精后，经过冷休克处理获得的。其特点是除具有银鲫的162条染色体外，还整合有团头鲂的微小染色体片段。由于微小染色体在F系银鲫传代过程中随机丢失，因此在2009年F系银鲫个体间分化严重，现选择生长最快的一尾个体繁育后代，其后代2010年依然分化严重；2011年再选择一尾具有明显生长优势的个体进行繁育后代，养殖半年后，后代性状基本一致，而且具有明显生长优势（F3）。生长数据如下：
高体型异育银鲫（D）：88.08 ±14.83；
异育银鲫“中科３号”（A+）：104.49±10.35；
复合鲫（F）3：146.4±21.83。
因此，2011年冬季体重测量表明，A+比D生长速度快18.63%；F3比A+快40.1%；比D快66.21%。
根据2011年的养殖结果，2012年春季主要开展了二项关于“生长快、抗病力强的银鲫候选新品系的筛选”的繁育工作：
1、挑选50尾F3进行人工繁育
（1）单独饲养1000尾于关桥39号池---观察后代分化情况
（2）重复两组：1000尾F3和1000尾A+ ，分别于关桥基地35号和2号大池----与中科3号进行生长性状比较
（3）重复两组：300尾F3，300尾A+，150尾D，分别于蔡甸基地2和3号池（养殖该池的鱼易感染吴李碘泡虫）----与中科3号、高体型异育银鲫D进行抗病性状比较
2、从F2中挑选不同体重的6尾个体，从F3中挑选3尾个体，以及1尾A+，1尾D分别进行人工繁育，随机挑选1000尾水花养殖在35号10个网箱中，待长大至1两左右注射标记混养。希望从中再选育出其他生长快速的优势Ｆ系个体。
（二）抗病分子标记工作
1、进一步将肝脏标记基因阿朴脂蛋白14的抗血清和吴李碘泡虫的抗血清进行双色免疫荧光共定位分析，通过对处于正常、轻微、中度和重度感染吴李碘孢虫的高体型异育银鲫D系、以及处于正常、轻微感染吴李碘孢虫的中科3号的肝脏切片分析，揭示：⑴与高体型异育银鲫相比，异育银鲫“中科3号”具有抗吴李碘孢虫在肝脏大量增殖的能力。⑵具有抗菌活性的阿朴脂蛋白-14，在宿主防御吴李碘泡虫侵袭的过程可能发挥了一定的作用。
2、对免疫相关基因MHC（主要组织相容性复合体）基因进行了初步研究，结果表明，不同品系异育银鲫的MHCIα基因具有丰富的多态性，在易感品系D系中初步筛选出两个转录水平高的基因型，在抗性品系A＋系中初步筛选出一个转录水平高的基因型。
   由于水生所关桥试验基地水质不太理想，加上武汉市想将这块地开发房地产，市里已基本和水生所商定，在水质优良的梁子湖划出800亩土地用于建设新的水生所试验基地。此基地离水生所只有1个多小时车程，将对课题今后的实施产生很好的保证作用。

四、对这三个课题实施情况的一些想法
1、总体上长江所已培育出“长丰鲢”，水生所异育银鲫“中科4号”选育工作也在进行中，但长江所和水生所鳙的选育工作由于鱼性成熟周期长，只能按照自然规律按部就班进行，2013年专项到期时估计难出大的成果，对延续项目实施倒是有了较丰富的材料。
2、分子标记工作，估计能取得一些进展，结论性结果有困难。对李忠实验结果与前人理论不一致处，除了课题组利用多种技术从不同层次、不同角度进行验证外，拟鼓励到高水平杂志投稿以获得专家意见，同时能否在专项范围内召集专家对其进行研讨。