加州鲈/乌鳢分子育种技术研究与应用

1、加州鲈分子育种技术研究与应用

（1）加州鲈分子标记开发与生长关联性研究

①获得了大口黑鲈(Micropterus salmoide) 促生长激素释放激素（growth
hormone releasing hormone, GHRH）基因启动子序列，该序列全长1452bp。在大口黑鲈GHRH基因启动子上还发现一个66bp长度的Indel突变位点，经软件预测，该突变位点上存在Homeobox,
FoxO转录因子结合位点各一个。针对该位点选取杂合子基因型亲本构建AB×AB家系，后代基因型频率显示纯合缺失突变BB型个体在出膜前死亡。利用实时定量PCR技术检测同一家系内不同基因型个体间基因的表达量，结果表明，AA基因型个体（9个样本）GHRH的表达量比AB基因型（10个样本）个体表达量偏高约19％，但差异未达显著水平（p>0.05）。在随机群体中验证结果表明，A（野生型）等位基因频率（0.856）明显高于B（突变型）等位基因（0.144），群体处于平衡状态（p=0.17），但未检测到BB型个体。AA型与AB型个体在体重、体长、体宽方面均没有显著差异。群体关联，家系验证结果均表明，该位点纯合子突变个体（BB）无法存活，AB及AA个体间基因表达水平及生长性状间没有显著差异。

②在大口黑鲈Pit-1基因5侧翼序列区的-18和-183位点发现了两个SNP突变位点，两个位点可组成3种单倍型。经生长关联性分析发现，AB和AA两种单倍型跟生长显著相关。

③采用AFLP分子标记技术构建加州鲈遗传连锁图谱，64种AFLP选扩引物组合共检测到2135个分子标记，有483个标记在群体中呈现多态性，平均每对引物产生7.55个标记，多态性片段中，189个母本分离标记，209个父本分离标记。其中85个偏离1:1孟德尔分离规律（P<0.05），17个属于母本，28个属于父本，偏分离比例为11.3%。雌性框架图包括75个遗传标记，分布在21个连锁群中，有6个三联体，6个连锁对。标记间平均间隔为18.22cM，图谱总长度为983.8 cM；雄性框架图包括82个遗传标记，分布在22个连锁群中，有7个三联体，5个连锁对。标记间平均间隔为19.22cM，图谱总长度为1153.2。雌雄基因组估算长度分别分1399.85和1582.72.，图谱的总覆盖率分别达到了70.28%和72.86%。

（2）加州鲈选育研究

       ①在南海区九江镇开展加州鲈群体选育第5代试验鱼的培育工作，并在佛山市南海区九江镇、顺德区勒流镇和湖南省益阳市开展相关的对比试验，继续评价选育效果。加州鲈经5个世代的选育，生长速度比非选育养殖群体生长速度增长了17.8-25.3%，选育效果明显，已通过国家原良种审定委员会的审定，养殖新品种定名为“优鲈1号”。

②采用约束最大似然法（REML法）对大口黑鲈4和6月龄的体重、体长、体高性状的遗传参数以及育种值进行估计，结果显示：4和6月龄的体重遗传力分别为0.29±0.08和0.28±0.10，体长遗传力分别为0.31±0.08和0.26±0.10，6月龄的体高遗传力为0.29±0.10，这些性状的遗传力都属于中度遗传力（P<0.01），表明在加性效应控制下，大口黑鲈的生长性状具有较大的遗传改良潜力。4和6月龄的体重与体长的遗传相关分别为0.750±0.082和0.790±0.094。6月龄的体重与体高的遗传相关为0.820±0.081，体长与体高的遗传相关为0.990±0.001，这些性状之间均表现为高的正遗传相关性（P<0.01），说明在对其中某一性状进行选择的同时，其他形态学性状也可以获得相应的间接选择反应。

2、乌鳢分子育种技术研究与应用

（1）乌鳢性别分子标记筛选研究

    ① AFLP标记：参照Vos等的方法，用EcoR I和Mse I（Tru1I）对基因组进行双酶切后连接接头，预扩增后进行选择性扩增，使用的接头序列、预扩及选扩引物序列见表1。扩增产物进行变性后在6％变性聚丙烯酰胺凝胶中进行分离。本实验分别取雌雄乌鳢各30尾，经过对72对引物组合筛选后，发现各引物对均能扩增出稳定清晰的条带，但未发现具有雌雄特异性的条带。

       ② 微卫星标记：筛选了139对微卫星引物。获得2个在一个家系中具有性别特异性的微卫星标记，该标记在雌性中60%的个体中出现，而在雄性中没有出现。在家系中增大样本数的验证中，该标记仍表现出性别特异性，但在野生群体中验证时，特异性消失。

（2）乌鳢性逆转试验

采用不同雌性激素、剂量和作用时间对乌鳢幼苗（刚开口）进行雌性逆转试验，得出较佳的逆转方法：将乌鳢幼苗置于100ppm17．a乙炔基雌二醇水体中连续处理12天，每2天换水一次，投喂以浮游动物；从第13天开始，将17．a乙炔基雌二醇加入鱼靡中拌匀，剂量为30mg/Kg，连续处理20天。获得试验鱼232尾，雌鱼218尾，雄鱼14尾，雌性率94%，而对照组的雌性率45%。

（3）性逆转鱼的繁殖试验

       ① 进行5批次共15尾雌鱼的雌核发育繁殖试验，未见有正常卵细胞分裂，没有鱼苗孵出。

       ② 进行3批次28尾雌鱼与普通雄鱼自然配对繁殖试验，有21尾正常产卵，能受精孵化出鱼苗的13尾，将这13尾雌鱼标记后继续保养，并将其仔鱼分别置于13个土池培育养殖，以备日后进行性别比例统计。

（4）杂交母本斑鳢的遗传多样性研究

对来源于佛山、郁南、花都和中山的4个斑鳢群体进行了遗传多样性分析，结果，佛山和中山群体的一致性最高，为0.9402,；其次是中山和花都的，为0.8410,；然后是郁南和花都的，为0.8176；佛山和郁南的一致性最低，为0.7285。